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AFLP/扩增片段长度多态性分析
一、 原理
AFLP也是通过限制性内切酶片段的不同长度检测DNA多态性的一种DNA分子标记技术。但AFLP是通过PCR反应先把酶切片段扩增，然后把扩增的酶切片段在高分辨率的顺序分析胶上进行电泳，多态性即以扩增片段的长度不同被检测出来。实验中酶切片段首先与含有与其共同粘末端的人工接头连接，连接后的粘末端顺序和接头顺序就作为以后PCR反应的引物结合位点。实验中，根据需要通过选择在末端上分别填加了1～3个选择性核苷的不同引物，可以达到选择性扩增的目的。这些选择性核苷酸使得引物能选择性地识别具有特异配对顺序的内切酶片段，进行结合，导致特异性扩增。
二、实验试剂、仪器
试剂：
Taq酶(Fermentas)、EcoRI/ MseIEcoRI/ MseI接头、E+A引物M+C引物、T4 DNA Ligase E和M引物、琼脂糖（西班牙）、过硫酸胺（Bioshap）、丙烯酰胺（Bioshap）、尿素（Bioshap）、硝酸银(国药)、甲酰胺（Bioshap）、TAE（深圳凯联生物）、 dNTPs（wolact）、 二甲苯青（Bioashap）、冰醋酸(国药)、玻璃硅烷、50bp Marker（TakaRa）、Wolact® Plant Genomic DNA Purification Kit（wolact）、T4 DNA Ligase（TakaRa）、
仪器：
Qiagen TissueLyser II研磨仪
Thermo ST16R 冷冻离心机
伯乐公司S1000 PCR仪
上海森信水浴锅
北京君意电泳仪和垂直电泳槽
佳能数码相机
三、操作步骤
（一） 基因组DNA提取和纯化
用Wolact® Plant Genomic DNA Purification Kit 提取叶片基因组
（二）限制性酶切及连接
基因组DNA 用MseI + Ecor I 双酶切，灭活。
在0.2ml离心管中加入：酶切产物约为250ng，2.5μl 10×酶切缓冲液， 2.5μl 10×T4DNA连接酶切缓冲液，5U EcoRⅠ， 5U MseⅠ，2U T4连接酶，50pmol MseⅠ接头，双蒸水补至25μl。用伯乐公司S1000PCR扩增仪设定37℃过夜反应后，于65℃20min灭酶活，－20℃保存，作为预扩增模板。
（三）预扩增
取3μl酶切连接产物，加入75ng E+A，75ng M+C引物，15mmol/L Mg2+，25mmol/L dNTPs，1U Tag酶，3μl 10×PCR缓冲液，加双蒸水补至30μl。反应参数为：94℃90s；94℃30s，56℃1min，72℃1min，30循环；72℃10min（伯乐公司S1000 PCR仪）。反应结束后，取3μl产物释稀50倍，用作选择性扩增模板。
（四）选择性PCR扩增
取释稀后的产物3μl，加入EcoRⅠ选择性引物、MseⅠ选择性引物各75ng，15mmol/L Mg2+，25mmol/L dNTPs，2UTag酶，3μl 10×PCR缓冲液，加双蒸水补至30μl。反应参数为：94℃90s；94℃30s，65℃1min，72℃1min，13循环（每循环降0。7℃）；94℃30s， 56℃1min，72℃1min，25循环；72℃5min（伯乐公司PCR仪）。
（五）凝胶电泳
扩增产物用6%变性聚丙烯酰胺胶（厚度0.5mm）和1×TBE电泳缓冲液电泳分离（君意公司电泳仪）。拔出梳子，140W恒功率预电泳30分钟，温度达到47～49℃。务必使每个孔清洗出尿素。选择性扩增产物中加入等体积上样缓冲液（98%甲酰胺，10mmol/LEDTA，0.25%二甲苯青，0.25%溴酚蓝）94℃变性5min（伯乐公司PCR仪），结束后迅速置于冰上直到点样。每个泳道加样8μl。一开始用100W恒功率电泳约2分钟，使样品迅速集中到孔底部，再调到60W恒功率电泳，温度保持在43℃左右，至二甲苯青FF至玻璃板2/3处，结束电泳。
（六）银染
固定液：取100ml冰醋酸到900ml去离子水或双蒸水中。染色液：1g AgNO3 ，1.5ml 37% 甲醛，加去离子水至1L。显色液：30g Na2CO3，1.5ml 37% 甲醛，2mg硫代硫酸钠，加去离子水至1L。
① 电泳完毕后，将粘有凝胶的玻璃板置入用于银染的塑料盘中。
② 固定：加入固定液，在摇床上轻微震荡30min。固定结束后，固定液保留。
③ 加入去离子水漂洗3次，每次2min。
④ 染色：将凝胶放入染色盘中，倒入染色液（4℃），在摇床上轻微震荡30min。用去离子水漂洗凝胶10秒钟后，置入显色盘中。
⑤ 显色：加入显色液（4℃），在摇床上轻微震荡直至条带数不再增加为止。
⑥ 终止：加入b步骤用后的固定液，来回漂几分钟。达到更好效果后，用蒸馏水漂洗几分钟。
⑦ 去除凝胶和玻璃板上的水珠后，放在白光灯箱上用佳能数码相机拍照。
（七）数据分析
用BIO-RAD公司的Quantity One 软件统计，再用NTSYS软件聚类分析构建聚类图。 |
