微生物基因组从头测序
简介：
微生物广泛存在于自然界中，与人类的生产和生活息息相关。微生物生物多样性丰富，基因组具有相对较小、重复序列较高、易于突变等特点，因此很必要对微生物进行全基因组测序，而且同动植物相比较在时间和成本上也容易实现。目前，全基因组测序成为微生物遗传进化、疾病预防控制、生物工程技术等方面重要的研究和开发手段。
一、技术路线
 Illumina MiSeq
二、生物信息分析
1. 原始数据整理、过滤及质量评估
2. Survey 分析 （基因组大小估计）
3. 基因组拼装与分析：
♦序列拼装
♦ 拼装统计（N20、N50、N90、总拼接长度、更长拼接长度、GC含量、总序列数量、>1 kb序列数量、N数量、N比例、测序深度等）
♦测序深度分布图
♦基因组圈图绘制（仅适用于完成图）
4. 功能元件分析
5. 蛋白编码基因功能注释:
♦序列比对 （数据库：refseq）
♦GO注释 （数据库：refseq）
♦COG注释 （数据库：eggNOG）
♦KEGG注释（KAAS，BBH）
6 比较基因组学分析：
♦基因家族分析（共有基因，特有基因分析）
♦共线性
♦基于 16s rDNA或 18s rDNA的进化分析
三、结果展示
四、样品要求
1、细菌：Miseq DNA PE文库浓度≥20 ng/ μl，总量≥6 μg（荧光定量）；Miseq DNA MP文库浓度≥40 ng/ μl，总量≥12 μg（荧光定量）；454 DNA库浓度≥20 ng/ μl，总量≥3 μg（荧光定量）。电泳检测无明显RNA条带，基因组条带清晰、完整，主带应在100 kb以上，DNA无降解，无污染提供菌粉＞1 g，菌液＞5 ml，尽量提供较多量，不同的物种DNA提取产量有差异。
2、真菌：Miseq DNA PE 文库浓度≥20 ng/ μl，总量≥6 μg（荧光定量）；Miseq DNA MP 文库浓度≥40 ng/ μl，总量≥12 μg（荧光定量）；454 DNA库浓度≥20 ng/ μl，总量≥3 μg（荧光定量）。提供组织样品应＞1 g，尽量提供较多量，不同的物种DNA提取产量有差异。
3、样品保存期间切忌反复冻融。
4、送样管务必标清样品编号，管口使用Parafilm 膜密封。
5、提供DNA电泳检测照片，用自封袋密封后随样品一起送样。
五、测序优势
1.平台优势：拥有ABI 3730 XL、Roche 454 FLX+、Illumina Miseq和Illumina HiSeq2000高通量测序平台，多种平台联合应用，优势互补，满足客户不同需求。
2.技术团队：拥有经验丰富的技术人员，专业的生物信息团队和大型计算机服务系统，可提供个性化生物信息分析服务。
3.项目周期：个人型测序平台，无需长时间凑样上机，极大缩短项目周期。
经典案例1：
海豚链球菌全基因组测序
背景：海豚链球菌是革兰氏阳性致病菌，不仅能够感染淡水、咸水鱼类，而且能够感染人类，被认为是对水产养殖业发展影响更大的致病菌之一。
目的：运用Roche 454 FLX+、Illumina MiSeq平台对海豚链球菌SF1进行全基因组测序，从而对海豚链球菌SF1的蛋白编码基因，信号通路转导，碳水化合物代谢，以及如何对抗宿主免疫应答反应等进行研究分析，了解其致病机制。
结果：海豚链球菌SF1的全基因组大小为2.15 Mb，GC%含量为36.7%，共注释到2125个蛋白质编码基因，预测到45 tRNA基因和12 rRNA基因。CRISPR/Cas系统是目前发现存在于大多数细菌与所有的古菌中的一种后天免疫系统，以消灭外来的质体或者噬菌体，并在自身基因组中留下外来基因片段作为“记忆”，本研究在SF1中发现一个CRISPR位点和4个Cas基因。通过进一步的蛋白质组学实验检测到SF1中21个被宿主血清诱导表达的分泌蛋白，为了进一步验证这些蛋白的功能，经过免疫效果实验显示其中的两个候选蛋白可以作为制备防治该种鱼病的疫苗使用。本研究结果为其他类型的海豚链球菌的研究提供了一个分子生物学理论基础，尤其是在对海豚链球菌的发病机制和对水产品疾病控制方面具有重要意义。
原文索引：[Zhang B C, et al. Streptococcus iniae SF1: complete genome sequence, proteomic profile, and immunoprotective antigens[J]. PloS one, 2014, 9(3): e91324.]
经典案例2：
条石鲷虹彩病毒全基因组测序
背景：虹彩病毒科是双链DNA病毒，包括5个病毒属，其中细胞肿大病毒属病毒可导致许多种水产养殖鱼类致病，因此对水产养殖业造成很大的威胁。
目的： RBIV-C1是从条石鲷中分离出来的虹彩病毒细胞肿大病毒属，通过对RBIV-C1病毒进行全基因组测序，全面掌握该病毒的全基因组信息，从而了解其基因表达模式，同时通过与其他已有基因组序列信息的虹彩病毒进行比对，探究其变异来源，并寻找RBIV-C1的特异性，为RBIV-C1病毒菌株的的鉴定寻找新的方法和依据，为鱼病的防治工作寻找新的思路。
结果：条石鲷虹彩病毒RBIV-C1的全基因组大小为112.3 kb，GC%含量为55%。同时发现RBIV-C1中有4584个简单重复序列，其中89.8%的简单重复序列分布在编码区，并预测到119个开放阅读框。另外与OSGIV和RBIV进行序列比对发现，它们的序列相似度达到99%，推测可能是同一病毒菌株的变异，在RBIV-C1基因组中发现了11个插入突变，13个缺失，103个SNP位点，这些变异位点可成为RBIV-C1鉴定的依据。通过进一步的qPCR全基因转录模式分析，显示119个开放阅读中有118个在活体感染时表达，并根据它们的表达模式，将其分为3个系统聚类，这一结果为细胞肿大病毒属的基因性能和基因表达特性的研究提供了新的参考。
原文索引：[ Zhang B C, et al. Complete genome sequence and transcription profiles of the rock bream iridovirus RBIV-C1. Dis Aquat Org, 2013, 104: 203-214.] |
