测序完成后对序列进行数据统计分析及基础的生物信息学分析，并可根据客户要求提供个性化分析服务（详情可参考生物信息学分析流程）。

生物信息学分析结果展示：

有效测序数据

多样品平行测序过程中，各样品通过Barcode标签序列区分样品，而测序所得的原始数据中可能含有没有任何样品信息的杂质序列，这些序列极有可能导致后续生物信息错误或意义不明。因此，需要先将这些序列从原始数据中移除，并根据样品标签筛选有效序列。

 优化分析数据

通常情况下，有效数据可以直接进行后续生物信息分析。如果需要得到更高质量及更精准的生物信息分析结果，将对有效测序数据进行修剪（trim）（去除bacode、primer、过短、过长、出现含糊碱基、含过长homologous及重复的序列），修剪后得到的数据即为优化数据。该过程可能出现抛弃一定量数据的情况，但可以保证得到更高质量的信息分析。

 

各样品序列数据统计

根据样品标签序列将待分析的序列分配到各样品中。

OTU生成

OTU（Operational Taxonomic Units）是数值分类最低等级的分类单位。有种、变种、个体等，在作群体分析时，根据相似系数值在一定标准进行归纳整理和聚类。在生物信息分析中，测序得到的每一条序列来自一个细菌。要了解一个样品微生物组成信息，就需要将序列按照彼此的相似性进行归类，每一类就是一个OTU。目前根据文献报道，通常按照96%-98%进行OTU的划分，也可根据客户指定的相似度或者微多样性出现时的相似度划分OTU，并对OTU进行生物信息统计分析，但是OTU划分和物种分类是不完全对应的。

多样性评估（Estimator）

多样性指数：Shannon—Wiener指数，Simpson指数；

丰富丰度指数：Chao1 ，ACE ；

测序的饱和度：Good’s coverage。

稀疏曲线 （Rarefaction curve）

Rarefaction即取样深度，是比较测序量不同的样本之间的物种丰富度，通过各样品的测序量及在不同测序深度的OTU数目构建稀疏曲线，以此反映单个样本测序数量对应的物种丰度。

全样品相似度分析

比较多个样品的OTU差异及各OTU中含有序列的多少，可以得到这些样品的相似关系。

显著性差异分析

分析多个样品时，如果这些样品分属于两种环境情况下，则可以进行Metastats分析。该分析通过对比两组条件下的多个样品，找出两者之间有明显差异性表达的因子。

 

OTU比较文氏图

按某一相似性划分OTU，并比较各样品OTU的分布，重合区域为各样品间共同的OUT。

分类学分析（Taxonomy）

序列数据分类（Classify）

将经过修剪的所有序列都与SILVA（106版本）数据库进行比对，找出与其序列最相近且可信度达80%以上的序列分类信息。之后，按照所划分的OTU，将每一个OTU中的序列进行类比，找出同一OTU中的不同序列的最近祖先的分类信息。此步骤不仅保留了尽可能多的信息量，又确保了所得信息的准确性。 

Heatmap

将指定种属水平上的分类信息按照样品和分类进行聚类后作出Heatmap图，即可反映出各样品在各分类水平上的差异

单样品微生物组成饼图及柱状图

对各样品中的微生物组成及其含量进行分析，并可利用柱状图比较不同样品间微生物组成的差异。

 PCA分析(Principal Component Analysis)

PCA分析，即主成分分析，是一种对数据进行简化分析的技术，这种方法可以有效的找出数据中最“主要”的元素和结构，去除噪音和冗余，将原有的复杂数据降维，揭示隐藏在复杂数据背后的简单结构。我们可以用PCA来分析不同样品OTU组成的差异，通过方差分解，将多组数据的差异反映在二维坐标图上，坐标轴各取能够最大反映方差值的两个特征值。若样品组成越相似，反映在PCA图中的距离越近。

UniFrac分析

UniFrac 是一种利用各样品中微生物序列间的进化信息计算样品间距离，两个以上的样品，则得到一个距离矩阵，并通过多变量统计学方法PCoA(principal co-ordinates analysis)进行处理。从结果中反映出各样品间微生物群落结构的差异。

RDA/CCA分析

RDA或者CCA是基于对应分析发展而来的一种排序方法，将对应分析与多元回归分析相结合，每一步计算均与环境因子进行回归，又称多元直接梯度分析。此分析是主要用来反映菌群与环境因子之间关系。RDA是基于线性模型，CCA是基于单峰模型。

图标注释：箭头表示环境因子，箭头所处的象限表示环境因子与排序轴之间的正负相关性，箭头连线的长度代表着某个环境因子与研究对象分布相关程度的大小，连线越长，代表这个环境因子对研究对象的分布影响越大。箭头连线与排序轴的夹角代表这某个环境因子与排序轴的相关性大小，夹角越小，相关性越高。

 

环境微生物多样性分析送样要求：

环境样品送样要求

1)         环境样品

2)         采样后务必立即将样品封存（冷冻保存，推荐液氮处理）。土壤、粪便、污泥、海水沉积物等样品量需＞1g，植物树枝叶片、堆肥等样品量需＞100g。

3)         样品保存期间切忌反复冻融。

4)         送样时使用干冰运输。

5)         请填写完整的送样订单，用自封袋密封后随同样品一起送样。

基因组DNA送样要求

1)         请提供OD值介于1.8～2.0之间，浓度＞10ng/μl，总量＞200ng的DNA，并确   保DNA无降解。

2)         送样管务必标清样品编号，管口使用Parafilm膜密封。

3)         样品保存期间切忌反复冻融。

4)         建议送样时使用干冰运输。

5)         请填写完整的送样订单和DNA电泳检测照片（浓度、总量和纯度必须符合送样要求），用自封袋密封后随同样品一起送样。

PCR产物送样要求

1)         请按照宝杰罗生物提供的PCR实验要求来进行引物设计和PCR扩增。

2)         PCR产物浓度＞10ng/μl，总量＞200ng，OD_260/280在1.8左右。

3)         PCR产物需经琼脂糖电泳切胶回收纯化。

4)         送样管务必标清样品编号，管口使用Parafilm膜密封。

5)         样品保存期间切忌反复冻融。

6)         送样时使用干冰运输。

7)         请填写完整的送样订单，并提供PCR产物纯化前后的电泳检测图片，用自封袋密封后随同样品一起送样。

试验周期

接到样本后30-40 个工作日

参考文献

Wu, S., G. Wang, et al. (2012). "Composition, diversity, and origin of the bacterial community in grass carp intestine." PLoS One 7(2): e30440.

Tingting wang, et al., (2011).” Structural segregation of gut microbiota between

colorectal cancer patients and healthy volunteers” ISME: 1-10.

Jiangchao Zhao, et al., (2012). “Decade-long bacterial community dynamics in cystic fibrosis airways” PNAS 109 (15): 5809-5804.